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Magline 试剂盒提取 DNA操作步骤
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Magline® 基因组 DNA纯化试剂盒提取基因组 DNA
Magline® 基因组 DNA纯化试剂盒提取全血基因组 DNA
 

 

操作规程

 

       1.    1.5 ml离心管,加入 Affimag磁珠悬液200 μl ,在 Affimag 磁分离架下分离弃去上清,加入200 μl 洗涤液,洗涤1次,弃去上清

        2. 冻存抗凝全血5 ml37 ℃温育, 4 ℃ 2500 rpm离心10 min ,吸取中间白细胞层至1.5 ml 离心管,加500 μ l生理盐水涡流混匀,4 ℃ 2500 rpm离心10 min,弃上清,重复洗涤一次

        3. 向管中依次加入200 μl 裂解液和经洗涤的Affimag磁珠,涡流混合,室温放置10 min,在 Affimag磁分离架下分离,弃上清液。

        4.  依次用80 %异丙醇200 μl 70%乙醇200 μl各洗涤2-3次,室温挥干。

        5.  加入洗脱液200 μl,涡流混合,室温放置10 min,在Affimag磁分离架下分离,吸取清液,得到DNA溶液。

注意事项  

       1. Affimag磁珠悬浮在PBS缓冲液中,使用前请充分混合均匀。
2. 本试剂盒应在 4℃冰箱中贮存,到货后六个月内有效。
3. 缓冲液含有刺激性化合物,操作时请戴乳胶手套,避免沾染皮肤和眼睛。
 

常见问题分析
 

常见问题

可能原因与建议

DNA得率较低

全血样品中白细胞含量过低,更换新的全血样品;

步骤 2洗涤过程中将白细胞丢失,在规定转速下进行离心;

样品贮存时间过长,使用新鲜的全血样品有助于提高 DNA的收率;

在步骤 4的淋洗过程中将 DNA丢失,小心操作除去异丙醇和乙醇,降低 DNA的损耗。

DNA片段降解

样品的收集与贮存方法不适合,选择在最佳条件下获得的全血样品

 

Magline® 基因组 DNA纯化试剂盒提取动物组织基因组 DNA
 

 

操作规程

 

 

样品预处理步骤:
        取动物组织(如小牛胸腺) 1.0 g,液氮冷冻研磨至粉末,加入2 ml Lysis BufferB,涡流混合 5 S,室温下裂解10 min 3000 rpm离心10 min,吸取上层清液作为裂解液 4℃保存备用。
提取步骤:
        1、在1.5 ml Eppendorf管中加入磁珠悬液1 ml,在磁场下分离弃去上清,加入1 ml PBS缓冲液洗涤2次;
        2、加入100
μl上述细胞裂解液,1 ml Binding Buffer,涡流混合,室温放置10 min
        3、磁场下分离,弃去上清液;
        4、依次用1 ml Washing BufferA 1 ml Washing Buffer B 各洗涤2次,风干;
        5、加入Ellution Buffer 200
μl,室温下洗脱 10 min,磁场分离,吸取清液,得到 DNA溶液。

注意事项

  同上
Magline® 基因组 DNA纯化试剂盒提取植物组织基因组 DNA
 

 

操作规程

 

 

样品预处理步骤:
        取植物组织(如玉米胚芽)2.0 g,液氮冷冻研磨至粉末,加入10ml Lysis BufferA,混匀,加入10 % SDS 400
μl,混匀, 65℃水浴30 min, 吸取上层清液作为裂解液4℃保存备用。
提取步骤:
       1、在 1.5 ml Eppendorf管中加入磁珠悬液1 ml,在磁场下分离弃去上清,加入1 ml PBS缓冲液洗涤2次;
       2、加入400 μl上述细胞裂解液, 1 ml Binding Buffer,涡流混合5 S;室温放置10 min
       3、磁场下分离,弃去上清液;
       4、加入1 ml Washing BufferA Washing BufferB各洗涤1次,风干;
       5、加入Ellution Buffer 200
μl,室温下洗脱 10 min,磁场分离,吸取清液,得到DNA溶液。
 

注意事项

  同上
   
Magline® 基因组 DNA纯化试剂盒提取微生物基因组 DNA
 

 

操作规程

  样品预处理步骤:
       取处于对数生长期的细菌悬液(如酵母菌悬液) 40 ml 2000 rpm离心5 min,收集菌体沉淀,加入3 ml ActiveBuffer 30℃水浴 30 min,加入 Enzyme Buffer 3 ml 30℃水浴 60min 2000rpm离心5 min,收集沉淀,加入lysisBufferC3.0 ml, 55℃水浴10min吸取上层清液作为裂解液 4℃保存备用。
提取步骤:
       1、在1.5 ml Eppendorff管中加入磁珠悬液1 ml,在磁场下分离弃去上清,加入1 ml PBS缓冲液洗涤2次;
       2、加入500 μl上述细胞裂解液, 1 ml Binding Buffer,涡流混合 5 s ;室温放置10 min
       3、磁场下分离,弃去上清液;
       4、分别加入Washing BufferA Washing BufferB1 ml洗涤,风干;
       5、加入Ellution Buffer 200 m
l,室温下洗脱10 min,磁场分离,吸取清液,得到 DNA溶液。
 

注意事项

  同上。
   
组氨酸标记重组蛋白纯化试剂盒纯化蛋白
 

 

操作规程

  A 纯化前样品制备
     1. 吸取1 ml细胞培养液置于1.5-mL离心管,在6000 rpm离心5 min,弃去上清,将湿菌体置于冰上或在-20
或-70 下冷冻保存。
      2. 重悬湿菌体于1 ml吸附液中。
      3. 在冰上超声裂解细胞(超声4次,每次30 s,每次间隔10 s)。
      4. 在4
下,10000 rpm离心15 min,沉淀细胞裂解碎片。
      5. 收集上清备用。
B)蛋白吸附步骤
(下面的操作规程基于100 μl磁珠悬液,其蛋白结合容量为100 μg 组氨酸标记蛋白。 为获得最佳结果,应考虑磁珠用量与待纯化蛋白之间的匹配)
      6. 另取新鲜1.5-mL离心管,加入100 μl磁珠悬液和300 μl吸附液,涡旋混合。
      7. 将离心管置于Affimag磁分离架上,悬液因磁珠被吸附到壁上而逐渐变为澄清。弃去上清。加入300 μl吸附液,从磁分离架上取出离心管,涡旋混合,磁分离沉淀磁珠,弃去上清。
      8. 重复上述洗涤步骤一次。
      9. 向管中加入1 ml含组氨酸标记蛋白的样品溶液,室温下涡旋混合或振荡混合15 min。
C)洗涤步骤
     10. 将离心管置于磁分离架上,直到悬液变为澄清。弃去上清。从磁分离架上取出离心管,加入200 μl吸附液,涡旋混合,室温放置5 min,在磁分离架下分离,弃去上清。
     11. 重复洗涤3次。
D)洗脱步骤
     12. 加入200 μl1#洗脱液,涡旋混合,室温放置5 min,在磁分离架上分离磁珠,吸取清液,得到第一批纯化重组蛋白。
     13. 加入200 μl2#洗脱液,重复上述磁分离操作,吸取清液,得到第二批纯化重组蛋白。
 

注意事项

 

除上述注意事项外还需注意:

样品溶液中 EDTA EGTA、组氨酸等络合剂应予以除去,否则将影响纯化蛋白的收率。

常见问题分析
 

常见问题

可能原因与建议

重组蛋白得率较低

重组蛋白以包涵体形式存在,应离心收集包涵体,检测其中的蛋白含量。

细胞裂解液中的蛋白未被完全吸附,应增加吸附时间。

蛋白序列不正确,应重新测定克隆的序列。

重组蛋白被降解,在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。

吸附蛋白未被完全洗脱,增加洗脱液中的咪唑浓度。

重组蛋白纯度不够

内源性蛋白在磁珠上的非特异性吸附,在吸附液中加入10 mmol/L的咪唑,或增加洗涤次数,但可能会影响产品收率。

 

 
   
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