色谱法是利用物质在固定相和流动相之间分配系数的微小差异对混合物进行分离的方法。在这一方法中,将含有混合物的样品溶液引入由固定相和流动相组成的色谱柱系统。当两相作相对移动时,被测物质在两相之间进行反复多次分配,由于各组分分配系数的差异,它们以不同的速度通过色谱柱得以分离。色谱法不仅可以分离分析混和物,还可以用于测定化合物的物理化学常数。按照流动相的状态,色谱法可以分成气相色谱法和液相色谱法。
高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱,按照固液相之间的分配机理对混合物进行分离的方法。该技术的实施除了具有专用的高压输液系统和高灵敏度检测系统等设备之外,最关键的还需要有高效分离柱。分离柱是液相色谱的核心,高效分离柱填料的研究是现代液相色谱方法赖以建立和发展的基础.
高效液相色谱法由于具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的特点,特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离和分析,已成为应用最为广泛和有效的分离分析手段。从七十年代现代液相色谱出现至今,在短短几十年的时间里得到了迅速的发展和广泛的应用。现在,HPLC几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样。在目前已知的有机化合物中,若事先不进行化学改性,只有20%的化合物用气相色谱法可以得到较好的分离,而80%的有机化合物需HPLC分析。因此,HPLC具有非常广阔的应用前景。
同其他分离技术相比较,HPLC方法的主要特点是:它的分离效率高,选择性好,适于各种多元组分复杂混合物的分离;它的应用范围从无机物到有机物,从天然物质到合成物质,从小分子到大分子,从一般化合物到生物活性物质等。可以说几乎包括了所有类型物质;它可以根据分离对象,按不同分离机理,广泛选择色谱柱、淋洗体系和操作参数;它即是精细的分离纯化方法,也是快速、灵敏、准确、简便的分析检测手段;它可以处理从痕量、微量到常量以至较大规模制备的样品量,可以实现在线检测和自动化操作。
2. 高效液相色谱法的应用
高效液相色谱法的应用非常广泛,目前,HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途,而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。例如;
1)作为人工合成药物的精制手段,用于除去少量杂质,特别是那些异构体的分离。值得提出的是,药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制,需要拆分光学异构体(即对映体),这是很困难的工作,而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体,从而达到分离的目的。
2)从一些复杂的混合物中排除干扰物质,并分析其中微量成分。
3)中草药有效成分的制备和分析。
4)环境监测和污染物的分析。这在环境污染日益严重的今天是非常重要的。
5)食品中营养成分和物质的分析。高效液相色谱为食品成分的分析和定量提供了迅速可靠的途径,如定量分析食品中蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等含量来确定食品的营养价值和品质。
6)手性分离技术目前已成为高效液相色谱十分重要和热门的应用领域。
20世纪90年代国际上兴起了一项为人类造福的高新技术产业——手性药物,这是医药界的一次重大变革。众所周知,药物对杂质的要求是很严格的,药物的纯度一般要求在98%以上,并对2%以下的杂质要明确其性质和副作用;而对于外消旋体药物等于有50%的杂质,因此药学界一个强烈的趋势就是特别着重于使用高光学纯度的单消旋体作为特效药,而拆分单一对映体药物的手性技术是当代高新分离分析技术领域的一项新发展。
早在1992年,FDA就规定:对于含有手性因素的药物倾向于发展单一对映体产品。后来又表示鼓励把已在销售的外消旋药物转化为手性药物;对于申请新的外消旋药物,则要求对两个对映体都必须提供详细的生理活性和毒理数据,而不得作为相同物质对待。据有关资料统计,1999年全球单一对映体药物的销售额为964亿美元;2000年,销售额突破1000亿美元,达到1330美元。到2001年,手性药物销售额已达到1472亿美元。预计手性药物到2010年销售额将达到2000亿美元。
根据FDA规定,今后研制具有不同对称中心的药物,必须给出手性拆分结果,欧共体也采取了相应措施,因此手性化合物的拆分和分离测定以成为药理学研究的前提和制药工业日益迫切的课题。手性药物在带来挑战的同时也带来机遇,传统的新药开发须要耗费2亿以上美元和10年左右的时间,而开发早期外消旋体药物的光学纯品(手性药物)仅只需要很少的研究经费和一年左右时间,这无疑给制药公司带来了一个极好的发展机会。
在手性药物的合成与生产中,除通过不对称合成的方法得到光学纯的化合物外,一般情况下得到的是由等量的对映异构体分子组成的外消旋体。拆分(Resolution)是制备光学纯对映异构体的重要途径。在工业化生产手性药物的实际过程中仍然主要采用拆分方法。经过许多年的发展,拆分方法以及手性分离测定的方法已变成涉及多学科的一项应用技术。手性化合物分离测定与拆分技术主要有:利用现代色谱法(高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳(HPCE)、超临界流体色谱(SFC))、物理化学拆分法、膜法、酶法。其中,现代色谱分离技术在对映体的分离与测定方面显示出巨大的优越性。在色谱分离技术中,HPLC技术具有十分重要的地位,HPLC手性分离技术拆分适用对象广泛,尤其为非挥发性和热稳定性差的手性药物的拆分提供了更为有效地途径,具有高效、简单、快捷的特点。对于一般的手性样品分离测定可在一次运行同时实现,对于更复杂的样品还可采用多维色谱技术,并可以与红外、质谱、核磁共振联用,为复杂样品的快速定性和定量分析提供了方便的途径。HPLC不但可以进行手性样品的纯度测定,还可对手性样品进行制备分类如:制备色谱、闭环循环色谱(CLRC)和模拟流动色谱法(SMB)都可以看成是HPLC技术的放大和衍生。
|