色谱柱在使用前准备

1、样品的前处理   2、流动相的配制 3、流动相流速的选择  4、注意事项 5、柱性能测试

色谱柱使用及维护

1、如何平衡色谱柱 2、色谱柱的再生 3、注意事项 4、色谱柱的维护

5、HPLC六通阀进样器的使用及保养

高效液相色谱法及其特点

    色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时需按照色谱柱出厂报告中的条件进行，只有这样，测得的结果才有可比性。

1 、样品的前处理：
      a .最好使用流动相溶解样品。
      b .使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
      c .使用 0.45 µm 的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2 、流动相的配制：

   液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
      a .流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中 ( 或长时间保留在柱中 ) 。
      b .流动相具有一定惰性，与样品不发生化学反应( 特殊情况除外 ) 。
      c .流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命 ( 可运用提高温度的方法降低流动相的黏度，从而降低柱压 ) 。
      d .流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用紫外检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
      e .流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
      f .在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，又可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3 、流动相流速的选择：

    因为柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为 4.6 mm 的色谱柱，流速一般选择1 ml/min ，对于内径为 4.0 mm 柱，流速设定 0.8 ml/min 为佳。 当降低流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间 ( 如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量 ) 。

4、注意：
       1 .对于正相柱，推荐使用沸程为 30-60 ℃ 的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水 ( 电阻率大于 18 兆欧 ) ，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
       2 .含水流动相在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相时不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
       3 .流动相要求使用 0.45 µm 滤膜过滤，除去微粒杂质。
       4 .推荐使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

5 、柱性能测试：

   a .流动相流速设定为 1 ml/min 。

   b .紫外检测器波长设定为 254 nm 。使用出厂测试时使用的流动相组成来测试样品。 记录并计算测试结果。

    每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！——请一定要做！

    反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在甲醇/水中的。请一定确保您所使用的流动相和甲醇/水互溶。在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。 硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正己烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡。

1.如何平衡色谱柱？

    平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）  

2.色谱柱的再生

    进行色谱柱再生时，建议使用相对廉价的泵，最好不使用您的高效液相色谱仪上的输液泵。

    表1　建议用来冲洗的溶剂体积

色谱柱尺寸　　柱体积　　所用溶剂的体积

150 × 4.6 mm　 1.6 ml　　　30 ml

250 × 4.6 mm　 3.2 ml　　　60 ml

250 × 10 mm　 20 ml　　　 400 ml

     请根据下表选择您的再生方法：

极性固定相（如Si，NH₂，Diol基色谱填料）的再生：

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水

非极性固定相（如反相色谱填料RP－C₁₈，RP－C₈，CN等）的再生：

水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水

0.05 mol/L稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

2.注意：

    在对NH₂改性的色谱柱进行再生时，由于NH₂可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1 mol/L的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05 mol/L稀硫酸冲洗非常有效。

3.色谱柱的维护：

    1. 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

    2. 大多数硅胶基质的色谱柱的pH使用范围是2－7.5，不要超过色谱柱使用的pH范围

    3. 避免流动相组成及极性的剧烈变化

    4. 流动相使用前必须经过滤和脱气处理

    5. 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在检测完毕后将柱子冲洗干净，并保存在乙腈中

    6. 柱压升高通常是需要更换预柱的信号

   六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。

   工作原理：

   1、手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；

   2、将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。

   虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。

   以下浅谈有关六通阀进样器的使用及保养事宜(仅供参考)：

   1、手柄处于"Load"和"Inject"之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器枕头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。

   2、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75%，如20 µL的定量环最多进15 µL的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20 µL的定量环最少进样60—100 µL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100 µL的平头进样针配合20 µL满环进样。

   3、可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10 µL的定量环，实际是9 µL还是1l µL并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。

   4、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45 µm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的"Load"和"Inject"位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。

   色谱法是利用物质在固定相和流动相之间分配系数的微小差异对混合物进行分离的方法。在这一方法中，将含有混合物的样品溶液引入由固定相和流动相组成的色谱柱系统。当两相作相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次分配，由于各组分分配系数的差异，它们以不同的速度通过色谱柱得以分离。色谱法不仅可以分离分析混和物，还可以用于测定化合物的物理化学常数。按照流动相的状态，色谱法可以分成气相色谱法和液相色谱法。

    高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机理对混合物进行分离的方法。该技术的实施除了具有专用的高压输液系统和高灵敏度检测系统等设备之外，最关键的还需要有高效分离柱。分离柱是液相色谱的核心，高效分离柱填料的研究是现代液相色谱方法赖以建立和发展的基础．

   高效液相色谱法由于具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的特点，特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离和分析，已成为应用最为广泛和有效的分离分析手段。从七十年代现代液相色谱出现至今，在短短几十年的时间里得到了迅速的发展和广泛的应用。现在，HPLC几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样。在目前已知的有机化合物中，若事先不进行化学改性，只有20%的化合物用气相色谱法可以得到较好的分离，而80%的有机化合物需HPLC分析。因此，HPLC具有非常广阔的应用前景。

    同其他分离技术相比较，HPLC方法的主要特点是：它的分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂混合物的分离；它的应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成物质，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。可以说几乎包括了所有类型物质；它可以根据分离对象，按不同分离机理，广泛选择色谱柱、淋洗体系和操作参数；它即是精细的分离纯化方法，也是快速、灵敏、准确、简便的分析检测手段；它可以处理从痕量、微量到常量以至较大规模制备的样品量，可以实现在线检测和自动化操作。

2. 高效液相色谱法的应用

    高效液相色谱法的应用非常广泛，目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。例如；

    1）作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。值得提出的是，药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制，需要拆分光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离的目的。

    2）从一些复杂的混合物中排除干扰物质，并分析其中微量成分。

    3）中草药有效成分的制备和分析。

    4）环境监测和污染物的分析。这在环境污染日益严重的今天是非常重要的。

    5）食品中营养成分和物质的分析。高效液相色谱为食品成分的分析和定量提供了迅速可靠的途径，如定量分析食品中蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等含量来确定食品的营养价值和品质。

    6）手性分离技术目前已成为高效液相色谱十分重要和热门的应用领域。

    20世纪90年代国际上兴起了一项为人类造福的高新技术产业——手性药物，这是医药界的一次重大变革。众所周知，药物对杂质的要求是很严格的，药物的纯度一般要求在98%以上，并对2%以下的杂质要明确其性质和副作用；而对于外消旋体药物等于有50%的杂质，因此药学界一个强烈的趋势就是特别着重于使用高光学纯度的单消旋体作为特效药，而拆分单一对映体药物的手性技术是当代高新分离分析技术领域的一项新发展。

    早在1992年，FDA就规定：对于含有手性因素的药物倾向于发展单一对映体产品。后来又表示鼓励把已在销售的外消旋药物转化为手性药物；对于申请新的外消旋药物，则要求对两个对映体都必须提供详细的生理活性和毒理数据，而不得作为相同物质对待。据有关资料统计，1999年全球单一对映体药物的销售额为964亿美元；2000年，销售额突破1000亿美元，达到1330美元。到2001年，手性药物销售额已达到1472亿美元。预计手性药物到2010年销售额将达到2000亿美元。

    根据FDA规定，今后研制具有不同对称中心的药物，必须给出手性拆分结果，欧共体也采取了相应措施，因此手性化合物的拆分和分离测定以成为药理学研究的前提和制药工业日益迫切的课题。手性药物在带来挑战的同时也带来机遇，传统的新药开发须要耗费2亿以上美元和10年左右的时间，而开发早期外消旋体药物的光学纯品（手性药物）仅只需要很少的研究经费和一年左右时间，这无疑给制药公司带来了一个极好的发展机会。

    在手性药物的合成与生产中，除通过不对称合成的方法得到光学纯的化合物外，一般情况下得到的是由等量的对映异构体分子组成的外消旋体。拆分（Resolution）是制备光学纯对映异构体的重要途径。在工业化生产手性药物的实际过程中仍然主要采用拆分方法。经过许多年的发展，拆分方法以及手性分离测定的方法已变成涉及多学科的一项应用技术。手性化合物分离测定与拆分技术主要有：利用现代色谱法（高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、毛细管电泳（HPCE）、超临界流体色谱（SFC））、物理化学拆分法、膜法、酶法。其中，现代色谱分离技术在对映体的分离与测定方面显示出巨大的优越性。在色谱分离技术中，HPLC技术具有十分重要的地位，HPLC手性分离技术拆分适用对象广泛，尤其为非挥发性和热稳定性差的手性药物的拆分提供了更为有效地途径，具有高效、简单、快捷的特点。对于一般的手性样品分离测定可在一次运行同时实现，对于更复杂的样品还可采用多维色谱技术，并可以与红外、质谱、核磁共振联用，为复杂样品的快速定性和定量分析提供了方便的途径。HPLC不但可以进行手性样品的纯度测定，还可对手性样品进行制备分类如：制备色谱、闭环循环色谱（CLRC）和模拟流动色谱法（SMB）都可以看成是HPLC技术的放大和衍生。